数字PCR技术

2016-03-14
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实验介绍
   数字PCR即Digital PCR(dPCR),是继一代普通PCR、二代荧光定量PCR之后的第三代PCR技术。相较于qPCR,数字PCR可直接数出DNA分子的个数,可以对起始样品绝对定量,是一种全新的核酸分子绝对定量技术。
dPCR与qPCR方法相比,本方法无需核酸标准品,定量的结果不再依赖于 Ct 值;又兼具qPCR方法的优点,且结果的精确度、准确性和灵敏度更佳。因此特别适用于依靠Ct值不能很好分辨的应用领域:拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究(如等位基因不平衡表达)、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等,在环境微生物和病原体基因的检测、遗传病、无创产前筛查、NGS数据验证等方面将具有更广阔的应用前景。
实验原理
   通过把稀释到一定浓度的DNA分子分布在一定数目的微滴中,使大部分微滴中的DNA分子数目为1或0,然后通过PCR扩增和荧光信号的累计读取阳性微滴数目,有荧光信号的微滴判读为1;没有荧光信号的微滴判读为0,再根据泊松分布计算出样本中的DNA分子数。
实验方法
1、样品DNA(或RNA)提取及模板制备
2、引物探针设计合成
3、PCR扩增
4、检测微滴
5、分析数据、显示结果


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